Hlavní
Bronchitida

Rekombinantní interferon

LÉČBY PŘIJÍMAJÍCÍCH DOVOLENÝCH POBYTŮ JSOU POVOLENÝ ZA PACIENT POUZE LÉČINKEM. TENTO POKYNY POUZE PRO LÉKAŘSKÉ PRACOVNÍKY.

Popis účinné látky Interferon alfa-2b lidský rekombinant / interferon alfa-2b.

Vzorec, chemický název: žádná data.
Farmakologická skupina: imunotropní látky / imunomodulátory / interferony; protinádorová činidla / další protinádorová činidla; antimikrobiální, antiparazitické a antihelmintické / antivirová činidla / činidla proti viru (s výjimkou HIV).
Farmakologický účinek: imunomodulační, protinádorové, antivirové, antiproliferační.

Farmakologické vlastnosti

Léčivo je syntetizováno bakteriálními buňkami kmene Escherichia coli SG-20050 / pIF16, do genetického aparátu, do kterého je vložen gen lidského interferonu alfa-2b. Léčba je protein, který obsahuje 165 aminokyselin, je identický ve vlastnostech a vlastnostech lidského leukocytového interferonu alfa-2b. Antivirový účinek se projevuje během reprodukce viru, léčivo se aktivně podílí na metabolických procesech buněk. Reakce se specifickými receptory na povrchu buněk iniciuje řadu intracelulárních změn včetně tvorby specifických enzymů (protein kinázy a 2-5-adenylát syntetázy) a cytokinů, které zpomalují syntézu ribonukleové kyseliny viru v buněčném a virovém proteinu. Zvyšuje fagocytární aktivitu makrofágů, zvyšuje specifický cytotoxický účinek lymfocytů na cílové buňky. Změny funkční aktivity imunokompetentních buněk, kvalitativní a kvantitativní složení cytokinů, které se vylučují, tvorba a sekrece intracelulárních proteinů. Potlačuje proliferaci nádorových buněk a tvorbu určitých onkogenů, které inhibují růst nádorů.
Maximální koncentrace léčiva při parenterálním podání se dosahuje za 2 až 4 hodiny. Po 20-24 hodinách po podání léčiva v krevní plazmě není definována. Koncentrace léčiva v séru přímo závisí na frekvenci a dávce. Metabolizuje se v játrech, vylučuje se hlavně ledvinami, částečně se nezmění.

Indikace

Terapie a prevence chřipky a akutních respiračních virových infekcí; mimořádná prevence klíšťové encefalitidy s klíšťaty imunoglobulinem; atopické nemoci, alergická rinokonjunktivitida, bronchiální astma během specifické imunoterapie.
Komplexní léčba u dospělých: akutní virový hepatitid B (střední a těžké onemocnění na počátku ikterického období až do pátého dne žloutenka (v pozdějších obdobích je lék méně účinný, cholestatická nemoc a rozvoj jaterní kómy, lék není účinný), akutní prodloužená hepatitida B a C, chronická aktivní hepatitida B a C, chronická hepatitida B s činidlem delta, leukémie chlupatých buněk, stadium IV rakoviny ledvin, maligní kožní lymfomy (primární retikulóza, mykotická houba, retikulomální sarkomatóza), bazální buňky a skvamózní karcinom
Komplexní léčba u dětí od 1 roku: respirační papilomatóza hrtanu, počínaje dnem po odstranění papilomů; akutní lymfoblastická leukémie v době remisí po ukončení indukční chemoterapie (4-5 měsíců remisí).

Způsob aplikace interferonu alfa-2b lidského rekombinantu a dávky

Interferon alfa-2b lidský rekombinant se injikuje intramuskulárně, subkutánně, do léze, subkonjunktiválně, požívá, topicky aplikuje. Dávkování, dávka, režim a trvání léčby jsou stanoveny individuálně v závislosti na důkazech, věku, stavu pacienta, toleranci léku.
Během léčby by měly být klinické krevní testy provedeny každé dva týdny, biochemické - každé 4 týdny. Pokud je absolutní počet neutrofilů menší než 0,50 x 10 9 / l a počet krevních destiček je menší než 25 x 10 ^ 9 / l, terapie by měla být zrušena. Pokud je absolutní počet neutrofilů nižší než 0,75 x 10 9 / l a počet krevních destiček nižší než 50 X 10 9 / l, doporučuje se dočasně snížit dávku léku dvakrát a opakovat analýzu po 1 až 2 týdnech; pokud jsou změny zachovány, doporučuje se terapie zrušit.
Pacient by měl být pečlivě sledován kvůli známkám poškození funkce jater. Užívání léku by mělo být přerušeno progresí příznaků.
S rozvojem reakcí přecitlivělosti (angioedém, kopřivka, anafylaxe, bronchospazmus) je léčivo zrušeno a je okamžitě předepsána vhodná léčba.
Je nutné pečlivě sledovat funkční stav ledvin v přítomnosti mírné a středně těžké dysfunkce ledvin.
Při dlouhodobém užívání léku se může vyvinout pneumonie a pneumonitida. Úleva od léku a podávání glukokortikosteroidů přispívají k úlevě od plicních syndromů.
Pokud dojde ke změnám na straně centrální nervové soustavy a / nebo psychiky, včetně deprese, je nutné pozorovat psychiatra během léčby a do šesti měsíců po jeho ukončení. Po ukončení léčby jsou tyto poruchy obvykle rychle reverzibilní, ale někdy trvá až 3 týdny, než se plně rozvinou. Doporučuje se konzultovat s psychiatrem a přerušit léčbu léky, pokud se objeví agresivní chování zaměřené na jiné osoby nebo sebevražedné myšlenky, příznaky duševní poruchy se zhoršují nebo se neobrací. Samovražedné myšlenky a pokusy jsou častější u pacientů v dětství a dospívání než u dospělých. Pokud je u dospělých pacientů s vážnými duševními poruchami (včetně anamnézy) považována léčba s použitím léku jako nezbytná, měla by být zahájena pouze tehdy, pokud se provádí léčba duševních poruch a příslušné individuální vyšetření. Použití drogy u pacientů do 18 let s vážnými duševními poruchami (včetně anamnézy) je kontraindikováno.
U pacientů s patologií štítné žlázy je třeba před zahájením léčby stanovit hladinu hormonu stimulujícího štítnou žlázu, její obsah by měl být v budoucnu monitorován alespoň jednou za 6 měsíců, a také v případě, že se objeví známky dysfunkce štítné žlázy. Použití drogy u těchto pacientů by mělo být pod kontrolou endokrinologa. Vzhledem ke zhoršení funkce štítné žlázy nebo zhoršení stávajících onemocnění, které nejsou léčitelné, je nutné drogu zastavit.
Při dlouhodobém užívání drogy je možné porušení viditelného orgánu. Před léčbou se doporučuje provést oftalmologické vyšetření. Pro případné stížnosti z varhany je nutná okamžitá konzultace s oftalmologem. Pacienti s onemocněním, u kterých může dojít ke změnám sítnice (arteriální hypertenze, diabetes a další), musí podstoupit oftalmologické vyšetření alespoň jednou za šest měsíců. V případě zhoršení nebo výskytu zrakových poruch je třeba zvážit vyloučení léčby.
Pacienti s pokročilou rakovinou a / nebo patologií kardiovaskulárního systému potřebují pečlivé sledování a kontrolu elektrokardiogramu. Pokud dojde k arteriální hypotenzi, je třeba zajistit odpovídající léčbu a odpovídající hydrataci.
Starší pacienti, kteří užívají lék ve vysokých dávkách, mohou mít kóm, zhoršené vědomí, encefalopatii, záchvaty. S vývojem těchto poruch a neúčinností snížení dávky je léčba zrušena.
Při dlouhodobém užívání léku se u některých pacientů mohou objevit protilátky proti interferonu. Typicky jsou titry protilátek nízké, jejich vzhled nezhoršuje účinnost léčby.
U pacientů po transplantaci může být imunosuprese léku méně účinná, protože interferon stimuluje imunitní systém.
Opatrnost je předepsána pacientům s předispozicí k autoimunitním onemocněním. S rozvojem příznaků autoimunitního onemocnění je nutné provést důkladné vyšetření a zhodnotit možnost pokračování léčby interferonem. Někdy léčba léky je spojena s exacerbací nebo s výskytem psoriázy, sarkoidózy.
Během léčby je třeba věnovat pozornost tomu, aby se zabývaly potenciálně nebezpečnými aktivitami vyžadujícími zvýšenou pozornost a rychlost psychomotorických reakcí (včetně jízdy) as rozvojem únavy, ospalosti, dezorientace nebo jiných nežádoucích účinků je nutné tyto aktivity opustit.

Kontraindikace

Přecitlivělost, závažné onemocnění kardiovaskulárního systému (nedávný infarkt myokardu, srdeční selhání dekompenzace stupni, vyjádřený srdeční arytmie), závažné alergické onemocnění, závažné jaterní a / nebo renální selhání, autoimunitní hepatitida, chronická hepatitida s dekompenzovanou cirhózou, duševních chorob a poruchy u dětí a dospívajících, epilepsie a další dysfunkce centrálního nervového systému, autoimunitní onemocnění v dějinách, zovanie imunosupresivní léky po transplantaci, patologie štítné žlázy, které nemohou být kontrolovány konvenčními terapiemi; těhotenství, období kojení, u mužů, jejichž partneři jsou těhotní.

Omezení používání

Těžká myelosuprese, jater a / nebo selhání ledvin, onemocnění štítné žlázy, psoriázy, sarkoidóza, chronické obstrukční plicní nemoci, diabetu, ketoacidóza sklon, poruchy srážlivosti krve, psychiatrické poruchy, zejména vést k depresi, sebevražedné myšlenky a historie pokusů.

Používejte během těhotenství a kojení

Použití drogy je kontraindikováno v těhotenství a kojení.

Nežádoucí účinky interferonu alfa-2b lidské rekombinantní

Kardiovaskulární systém a krev: přechodné vratné kardiomyopatie, arytmie, hypotenze, infarkt myokardu, leukopenie, lymfopenie, trombocytopenie, anémie.
Trávicí systém: sucho v ústech, bolesti břicha, nevolnost, poruchy trávení, hubnutí, poruchy chuti k jídlu, průjem, zvracení, pankreatitida, hepatotoxicita, zvýšení alaninaminotransferázy, alkalická fosfatáza.
Nervový systém a smyslové orgány: podrážděnost, deprese, nervozita, únava, úzkost, nespavost, poruchy schopnosti soustředit se, agresivita, myšlenky na sebevraždu, neuropatie, psychózy, poruchy sluchu, spojivka spodní kopule otok, zarudnutí a izolované folikulů sliznici oka, fokální změny v pozadí, snížená zraková ostrost, optická neuritida, krvácení sítnice, retinální arteriální a venózní trombóza, edém optického nervu.
Kůže: zvýšené pocení, vyrážka, svědění, ztráta vlasů, lokální zánětlivá reakce.
Endokrinní systém: změny štítné žlázy, diabetes mellitus.
Muskuloskeletární systém: rhabdomyolýza, bolesti zad, křeče na nohou, myositida, myalgie.
Respirační systém: faryngitida, dyspnoe, kašel, pneumonie.
Močový systém: selhání ledvin, zvýšení koncentrace kreatininu, močoviny.
Imunitní systém: autoimunitní patologie (revmatoidní artritida, vaskulitida, lupus-like syndrom), sarkoidóza, anafylaxe, angioedém, alergický edém, otok obličeje.
Jiné: chřipkový syndrom (horečka, zimnice, asténie, únava, únava, artralgie, myalgie, bolesti hlavy).

Interakce interferonu alfa-2b lidského rekombinantu s jinými látkami

Lék snižuje clearance a dvakrát zvyšuje koncentraci aminofylinu v plazmě.
Při kombinaci s amfotericinem B se zvyšuje riziko poškození ledvin, hypotenze, bronchospasmu; s busulfanem - veno-okluzivním onemocněním jater; s dakarbazinem - hepatotoxicitou; se zidovudinem - neutropenií.
Léčivo zvyšuje toxicitu doxorubicinu.
Při kombinaci s levotyroxinem mění sodík účinek, může být nutná úprava dávky.
Při použití spolu s pegaspargasem se zvyšuje riziko nežádoucích účinků.
Droga může snížit aktivitu izoenzymů cytochromu P-450, a tím ovlivnit metabolismus fenytoinu cimetidinu, vyzvánění, diazepam, warfarin, theofylin, propanolol, některé cytostatik.
Může zvýšit myelotoxické, neurotoxické, kardiotoxické účinky léků, které byly dříve nebo společně podány.
Nepoužívejte současně s léky, které inhibují centrální nervový systém, imunosupresivní látky (včetně glukokortikosteroidů).
Příjem alkoholu se během terapie nedoporučuje.
Při použití společně může hydroxymočovina zvýšit výskyt kožní vaskulitidy.
Při kombinaci s teofylinem je nutné kontrolovat koncentraci teofylinu v krevní plazmě a v případě potřeby upravit dávkování.

Předávkování

V případě předávkování léky se zvyšují nežádoucí účinky. Zrušení léčiva, provádějící symptomatickou a podpůrnou léčbu.

Obchodní názvy léčiv s účinnou látkou interferon alfa-2b lidské rekombinantní

Kombinované léky:
Interferon alfa-2b humánní rekombinantní + Difenhydramin: Ophthalmoferon®.

Farmgroup:

Zpětná vazba a komentáře

GMO - tam je GMO, se všemi jeho

Petr Ne, 25.2.2015 - 21:40

GMO - je GMO se všemi jeho důsledky.

pevná bočnice: pocení

Natalia Ne, 13.1.2015 - 13:00

pevné vedlejší účinky: pocit zimnice podrážděnost až do agrese, kašel hnačka, dokonce noční můry v noci, nechutné a ne droga, buďte opatrní a můžete zemřít

v sovětských dobách byli propuštěni

Ivan Út, 09/27/2016 - 20:01

V sovětských dobách uvolňovali interferon, který byl léčen a byl levný a účinný. není třeba znovu objevit kolo.

Měl jsem vedlejší účinky:

Xenia St, 23.11.2016 - 23:20

Měla jsem vedlejší účinky: vyrážka na obličeji a otok nohou. hrudníku Během příjmu interferonových prsou se zvýšila o 1,5.

Dosáhla se remise

Host Čt, 04/04/2018 - 11:30

Remise dosažená s chronickou myeloidní leukémií

Způsob výroby rekombinantního lidského interferonu alfa-2b, rekombinantního plazmidu a kmene pro jeho realizaci

Vynález se týká genetického inženýrství, biotechnologie, medicíny, farmakologie. Nová rekombinantní vícepópální plazmidová DNA pSX50, kódující syntézu lidského leukocytového alfa-2b lidského interferonu, jehož exprese je řízena promotory laktosy a tryptofanu a terminátor transkripce. V důsledku transformace buněk E. coli BL21 rekombinantní DNA plazmid pSX50 kmen příjemce získá kmen E. coli SX50 - leukocytů produkujících rekombinantní lidský alfa-2b interferon s produktivitou na 0,9-1,0 g alfa-2b interferonu s 1 litr kultivační médiu. Způsob výroby rekombinantní interferon alfa-2b je založen na generované rekombinantního kmene E. coli SX50 a jeho ponořená kultivace obsahující živné médium s nízkým obsahem tryptofanu kontinuálním přidáváním živin substrátu v biosyntéze, mechanickým rozrušením buněk mikroorganismů pomocí vysokého tlaku, rozpuštění agregovaného proteinu v koncentrovaný roztok guanidin hydrochloridu a následnou renaturaci interferonu ve fyziologickém pufru přítomnost chaotropních činidel a čistí třístupňovým chromatografické čištění na typ pryskyřice interferon Chelating Sepharose Fast Flow imobilizovanými ionty Cu 2, iontoměničovou chromatografií na výměnné pryskyřice CM typ iontových Sephsrose Fast Flow a gelovou filtrační chromatografií na Superdex 75. pryskyřice metoda typ umožňuje získat látku interferon více než 99% čistota podle elektroforézy při redukčních a neredukujících podmínkách při barvení gelů stříbrem a více než 98% podle RF HPLC a bez obsahu pyrogenů (test LAL) v množstvích ah ne méně než rozmezí 400-800 mg od 1 litr kultivačního média. 3 n. a 3 h.p f-ly, 6 ill.

Výkresy k patentu Ruské federace 2242516

Předkládaný vynález se týká geneticky upravených léčivých přípravků, získaných biotechnologie, a to způsoby pro průmyslovou produkci rekombinantních leukocytů interferon alfa-2b lidské lékařské účely (dále interferon), jakož i na rekombinantnm kmeny Escherichia coli (E. coli) a plasmidové DNA kódující syntézu interferonu.

Interferony jsou molekuly bílkovin s molekulovou hmotností od 15 000 do 21 000 daltonů, produkované a sekretované buňkami v reakci na virovou infekci nebo jiné patogeny. Existují tři hlavní skupiny interferonů: alfa, beta a gama. Tyto skupiny samy o sobě nejsou homogenní a mohou obsahovat několik různých molekulárních druhů interferonu. Bylo tedy izolováno více než 14 genetických variant interferonu alfa, které jsou zajímavé a jsou široce používány v medicíně jako antivirové, antiproliferační a imunomodulační činidla.

Známé způsoby výroby lidského leukocytového interferonu z lidských leukocytů lidské krve indukované viry a jinými induktory (SU1713591, RU 2066188, RU 2080873).

Hlavní nevýhodou těchto metod pro produkci interferonů je pravděpodobnost kontaminace konečného produktu lidskými viry, jako jsou virové hepatitidy typu B a C, virus imunodeficience atd.

V současné době je pro produkci interferonu rozpoznána slibnější metoda mikrobiologickou syntézou, která poskytuje možnost získat cílový produkt s výrazně vyšší výtěžností z poměrně nenákladného výchozího materiálu. Přístupy použité v tomto případě umožňují vytvářet varianty strukturního genu, které jsou optimální pro bakteriální expresi, stejně jako regulační prvky, které řídí jeho expresi.

Jako počáteční mikroorganismy se používají různé konstrukce kmenů Pichia pastoris, Pseudomonas putida a Escherichia coli.

Nevýhodou použití P. pastoris jako produkující interferon (JN Garcia, JA Aguiar et. Al. // Vysoká hladina exprese lidského IFN-2b v Pichia pastoris.//Biotecnologia Aplicada, 12 (3), 152 až 155, 1995), je extrémně obtížné podmínky fermentace tohoto typu kvasnic, nutnost přísně udržovat koncentraci induktoru, zejména methanolu, v procesu biosyntézy. Nevýhoda použití kmenů Ps. putida (SU1364343, SU1640996, SU1591484, RU1616143, RU2142508) je složitost fermentačního procesu s nízkou hladinou exprese (10 mg interferonu na litr kultivačního média). Produktivnější je použití kmenů Escherichia coli (Semin. Oncol., 1997, Iun; 24 (3 Suppl. 9): S9-41-S9-51).

Spolu s charakteristikami použitých kmenů účinnost procesu závisí do značné míry na technologii použitou pro izolaci a čištění interferonu.

Způsob získání interferonu, který zahrnuje kultivaci buněk Ps. putida, zničení polyethylenimin biomasa léčba, frakcionace síranem amonným, chromatografii s hydrofobními fenilsilohrome C-80, pH frakcionace lyzátu, jeho koncentrace a diafiltrace, iontoměničovou chromatografií na celulózy DE-52, s elucí s gradientem pH, iontová výměnná chromatografie výsledného elučního celulóza-CM -52, koncentrace průchodem přes kazetový filtr a gelovou filtrací na Sephadexu G-100 (SU 1640996). Nevýhodou této metody je vedle komplexní vícestupňové fermentace vícestupňová fáze po obdržení konečného produktu.

Nejvíce v blízkosti analog (prototyp) je možno uvést způsob výroby lidské leukocytové interferonu zahrnující kultivaci rekombinantní kmen E. coli, výsledný biomasy zmrazení při teplotě ne vyšší než -70 ° C, rozmrazení zničení buněk mikroorganismů s lysozymem, odstranění RNA a DNA zavedením lyzát v DNA-ase a čištění vybraného nerozpustné formy interferonu promytím roztokem pufru s detergentem, rozpouštění interferonu sraženina v roztoku hydrochloridu guanidinu a jednostupňové renaturace Čištění pomocí iontoměničové chromatografie. Jako producent byl použit kmen E. coli SS5, získaný za použití rekombinantního plazmidu pSS5 obsahujícího tři promotory: Plac, Pt7 a Ptrp, a genu alfa interferonu se zavedenými nukleotidovými substitucemi.

Exprese interferonu kmenem E. coli SS5 obsahujícím tento plazmid je řízena třemi promotory: Plac, Pt7 a Ptrp. Úroveň exprese interferonu je asi 800 mg na 1 l buněčné suspenze (RU 2165455).

Nevýhodou této metody je nízká zpracovatelnost použití enzymatické destrukce buněk, DNA a RNA mikroorganismu a jednofázové chromatografické čištění interferonu. To způsobuje nestabilitu procesu izolace interferonu, vede ke snížení jeho kvality a omezuje možnost použití výše uvedeného schématu pro průmyslovou výrobu interferonu. Nevýhody tohoto plazmidu a kmenu, který je na něm založen, jsou použití silného neregulovaného promotoru T7 fágu v kmeni E. coli BL21 (DE3) v plasmidu, ve kterém je gen T7 RNA polymerázy pod promotorem lac operonu a který vždy "proudí". V důsledku toho se v buňce kontinuálně vyskytuje syntéza interferonu, což vede k disociace plazmidu a snížení životaschopnosti kmenových buněk a v důsledku toho k poklesu výtěžku interferonu.

Úkolem vynálezu je vytvořit průmyslový rekombinanty kmene, produkujícího E.coli pomocí nového rekombinantní plasmidové DNA mají vysoké hladiny biosyntézu interferonu a rozvoje účinné průmyslových technologií pro lékařské účely interferon látky odpovídající kvality „Evropského lékopisu“ látka pro interferon alfa-2b.

Tento problém byl řešen vytvořením rekombinantního plazmidu pSX50 DNA a kmene Escherichia coli SX50, uloženého ve všech ruských sbírkách průmyslových kmenů Federálního státního jednotného podniku GosNII Genetics, číslo VKPM B-8550,

a způsob výroby rekombinantní interferon alfa-2b, založený na použití rekombinantního kmene E. coli SX50 a zajistit submerzní kultivaci v živném médiu s nízkým obsahem tryptofanu kontinuálním přidáváním živin substrátu v biosyntéze, mechanickým rozrušením buněk mikroorganismů pomocí vysokého tlaku, rozpuštění agregované proteinu v koncentrovaném roztoku hydrochloridu guanidinu s následnou renaturací interferonu ve fyziologickém pufrovacím roztoku x v přítomnosti chaotropních činidel a třístupňový chromatografickým čištěním typu interferonu pryskyřice Chelating Sepharose Fast Flow, imobilizovanou Cu + 2 iontů, iontovou výměnnou chromatografií na iontoměničové pryskyřice typu CM Sepharose Fast Flow a gelovou filtrační chromatografií na Superdex 75 typu pryskyřice.

Tento vynález poskytuje nové rekombinantní DNA plasmidu kopiích pSX50, kódující syntézu leukocytů lidského alfa-2b interferonu, jehož exprese je pod kontrolou tryptofanového a promotory laktózy a terminátorem transkripce. Plazmid pSX50 má 3218 párů bází (bp) a je charakterizován přítomností následujících fragmentů:

- Sekvence od 1 nukleotidu do 176 nukleotidů (n.) Zahrnuje 176 bp DNA fragment obsahující promotor tryptofanu (Ptrp);

- Sekvence od 177 n. do 194 n. zahrnuje syntetický fragment DNA o velikosti 18 p. O. obsahující sekvenci Shine Delgarno, která je odpovědná za zahájení translace;

- Sekvence od 195 n. 695 n. obsahuje DNA fragment o 501 p.o. obsahující sekvenci genu interferonu s následujícími nukleotidovými substitucemi: v poloze 37, nahradit A s C, v poloze 39 nahradit G T, v poloze 40 nahradit A s C, v poloze 42 nahradit G T, v poloze 67 nahrazující A s C, v poloze 69 nahradit G T, v poloze 70 nahradit A za C, v poloze 72 nahradit A za T, v poloze 96 nahradit G s A, v poloze 100 nahradit A s C na pozici 102 nahrazení A s T v poloze 114 nahrazení A s C v poloze 120 nahrazení C s G v pozici 126 nahrazení G za A v pozici 129 nahrazení G za A s 330 G k substituci C v pozici 339 substitucí G na A v poloze 342, substitucí G na A záměny v pozici 487 A na C, na pozici 489 A k substituci T v poloze 495, substitucí G na A;

- Sekvence od 696 n. 713 každý zahrnuje syntetický DNA fragment o velikosti 18 p. O., obsahující syntetický polylinker;

- Sekvence od 714 n. 1138 n. zahrnuje DNA fragment plazmidu pKK223-3 s 4129 n. 4553 n každý Velikost 425 bp, obsahující sekvenci striktního transkripčního terminátoru rrnBT1T2 ;

- Sekvence s 1139 N. 1229 n. zahrnuje DNA fragment plazmidu pUC19 s 2487 N. na 2577 př.nl. Velikosti 91 bp, obsahující promotor genu pro β-laktomázu (gen rezistence na ampicilin - AmrR);

- Sekvence od 1230 n. 2045 n. zahrnuje DNA fragment plazmidu pUC4K se 720 n. 1535 n. 816 bp, obsahující strukturní oblast kan genu;

- Sekvence od roku 2046 n. na 3218 n. zahrnuje fragment DNA plazmidu pUC19 od 1625 do 453 n. Velikost 1173 bp, obsahující sekvenci zodpovědnou za replikaci plazmidu (ori) a lac promotor (Plac ).

Obr. 1-5 znázorňuje konstrukční schéma a fyzickou mapu plazmidu pSX50.

Obrázek 6 ukazuje úplnou nukleotidovou sekvenci vytvořenou pro plazmid pSX50.

Kmen Escherichia coli SX50 byl získán transformací buněk Escherichia coli BL21 pomocí plazmidu pSX50 pomocí tradiční technologie genetického inženýrství. Kmen E.Coli SX50 se vyznačuje následujícími vlastnostmi.

Buňky jsou malé, rovné, zesílené tyčové, gramnegativní, risperadon. Buňky rostou dobře na jednoduchých živných médiích. S růstem na agaru "Difco" se vytvořily kulaté, hladké, konvexní, zakalené, lesklé, šedé kolonie s hladkými okraji. Při růstu kapalných médií (v minimálním médiu s glukózou nebo v LB-bujónu) vytvářejí intenzivní rovnoměrné drážky.

Aerob. Rozsah teplot růstu 4-42 ° C s optimálním pH 6,5-7,5.

Jako zdroj dusíku se používají jak minerální soli ve formě amonných a dusičnanových, tak organické sloučeniny ve formě aminokyselin, pepton, trypton, kvasničný extrakt atd.

Aminokyseliny, glycerin, uhlohydráty se používají jako zdroj uhlíku. Antibiotická rezistence. Buňky jsou rezistentní na kanamycin (až do 100 μg / ml).

Kmen interferonu produkujícího Escherichia coli 8X50.

Metoda, podmínky a složení média pro ukládání kmene

V L-arapeu s přídavkem kanamycinu na koncentraci 20 μg / ml pod olejem, v L-bujónu obsahujícím 15% glycerolu a příslušných antibiotik v ampulích při -70 ° C, v lyofilizovaném stavu v ampulích při + 4 ° C.

Kmen Escherichia coli SX50 je identifikován identifikátorem Bergi (1974) jako kmen druhu Escherichia coli.

Způsob průmyslové produkce alfa-2b interferonu

Vlastností navrhované metody je vývoj technologie, která umožňuje izolovat interferon z nerozpustné formy, která se hromadí během fermentace, což umožňuje výrazně zjednodušit technologickou schématu izolačního procesu a zvýšit výtěžnost cílového produktu.

Tento způsob zahrnuje kultivaci kmene Escherichia coli v kultivačním médiu SH50, s konstantním přidáváním živin substrátu, s výhodou glukóza a kvasinkový extrakt, v průběhu syntézy, s výhodou s nízkým obsahem tryptofanu, mechanické destrukci buněk mikroorganismů vysokým tlakem 700-900 bar, interferon rozpuštěného v pufru roztoku hydrochloridu guanidinu, renaturaci interferonu ve fyziologických pufrovacích roztokech za přítomnosti chaotropních činidel a následnou třístupňovou chromatografií Čištění interferonu na pryskyřicích chelatujících Sepharose Fast Flow imobilizovaných ionty Cu + 2, iontoměničovou chromatografii na CM iontoměničových pryskyřicích typu CM Sepharose Fast Flow a gelové filtrační chromatografii na pryskyřicích Superdex 75.

Optimální podmínky pro jednotlivé fáze získání interferonu jsou následující:

- fermentace se provádí s kontinuálním přidáváním substrátů během celého procesu, což způsobuje vysokou úroveň exprese interferonu;

- destrukce buněk se provádí v dezintegrátoru typu Gaulin při tlaku 900 bar;

- odstranění rozpustných buněčných složek (DNA, RNA, proteiny, lipopolysacharidy atd.) se provádí promytím nerozpustné formy interferonu pufrovými roztoky obsahujícími detergenty (Triton XI00, močovina atd.);

- sraženina obsahující interferon se rozpustí v tlumivém roztoku 6 M guanidin hydrochloridu;

- renaturace interferonu se provádí ve fyziologickém pufrovém roztoku obsahujícím chaotropní látky;

- třístupňové chromatografické čištění interferonu se provádí na Chelating Sepharose Fast Flow, imobilizovaném Cu +2 ionty, na katexu výměny CM Sepharose Fast Flow a gelovou filtrační chromatografií na pryskyřici typu Superdex 75;

- po každém chromatografickém čištění se sterilizační filtrace provádí přes filtry bez pyrogenů s velikostí pórů 0,22 um.

Výstup interferonu při aplikaci popsaného způsobu je přibližně 400 až 800 mg interferonu s 1 1 kultivačního média. Kvalita získaného produktu splňuje normy a požadavky "Evropského lékopisu" pro látku alfa-2b interferon.

Významné rozdíly navrhované metody z prototypu jsou:

- použití konstrukce kmene s vyšší produktivitou, která umožňuje získat během biosyntézy větší množství interferonu z 1 1 kultivačního média;

- použití účinné mechanické destrukce buněčné biomasy, která umožňuje získat čistší extrakt nerozpustné formy interferonu v kratší době s menšími ztrátami;

- použití fyziologických roztoků pufru v případě renaturace v přítomnosti chaotropních činidel umožňuje zvýšit výtěžnost správně nenasycené formy interferonu;

- třístupňový chromatografickým čištěním interferonu produkuje látku interferon více než 99% čistého elektroforézou za redukujících a neredukujících podmínek s barvením stříbrem gelů a více než 98% podle HPLC, RF a v podstatě prostý pyrogenů (LAL-test).

Povaha a výhody nárokované skupiny vynálezů jsou ilustrovány následujícími příklady.

Příklad 1 Konstrukce rekombinantních plazmidů pS50

Způsob konstrukce plazmidu pSX50 zahrnuje následující kroky:

- konstruování vektorového plazmidu pSX10;

1. konstrukce plazmidu pSX3 (2641 bp)

2. konstrukce vektorového plazmidu pSX10 (2553 bp)

- konstrukce rekombinantního plazmidu pSX41 (3218 bp);

- konstrukce rekombinantního plazmidu pSX43 (3218 bp);

- konstrukce rekombinantního plazmidu pSX45 (3218 bp);

- konstrukce rekombinantního plazmidu pSX50 (3218 bp).

Konstrukce vektorového plazmidu pSX10

Plazmid pSX10 vektoru je vektor pUC19, ve kterém je kódující sekvence beta laktomázového genu, poskytující rezistenci na ampicilin, nahrazena kódující sekvencí kan genu a obsahuje terminátor transkripce z plasmidu pKK223-3.

Konstrukce vektorového plazmidu pSS10 se provádí ve dvou fázích:

- získání plazmidu pSX3 (2641 bp), což je plazmid pUC19, ve kterém je kódující oblast genu amp nahrazena kódující oblastí kan genu;

- Produkce pSX10 veterinárního plazmidu (2553 bp), což je plasmid pSX3, ve kterém je za BamHI místo vložen fragment DNA kódující terminátor transkripce gtBT 1T2.

Aby se získaly plazmidy, pSX3 strávil pět kuse amplifikace DNA pomocí PCR (polymerázová řetězová reakce). Během prvního kola s použitím DNA plazmidu pUC19 jako templátu byla provedena amplifikace DNA fragmentu o velikosti 1828 bp. (fragment PU1-PU2) za použití primerů:

Tato a následná PCR reakce se provádějí za následujících podmínek: 20 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10 mM (NH4).2 SO4,10 mM KCI, 2 mM MgCl2, 0,1% Triton X100,0,1 mg / ml BSA, 0,2 mM každé dNTP, 1,25 jednotek. Pfu DNA polymerázy, 100 ng DNA. Proces amplifikace se skládá z následujících stupňů: zahřívání při 95 ° C po dobu 5 minut, 35 cyklů PCR (30 sekund 95 ° C, 30 sekund 56 ° C, 2 minuty 72 ° C) a inkubace 10 minut při 72 ° C. Po amplifikaci (a po následných amplifikacích) se fragment DNA čistí elektroforézou v 1% agarózovém gelu. Během druhého a třetího kola s použitím DNA plazmidu pUC4K jako templátu se provede amplifikace fragmentu DNA o velikosti 555 bp. (fragment KM1-KM2) za použití primerů:

a amplifikaci velikosti fragmentu DNA 258 p. (KMZ-KM4) s primery

Dále se fragmenty (KM1-KM2) a (KM3-KM4) kombinují ve čtvrtém kole amplifikace za použití primerů KM1 a KM4, čímž se získá fragment DNA o velikosti 813 bp (KM1-KM4) kódující strukturní část kan genu.

Páté kolo PCR bylo provedeno sdružení fragmenty (PU1-PU2) a (KM1-KM4) za následujících podmínek: zahřívání při teplotě 95 ° C po dobu 5 minut, 5 cyklů PCR (30 s 95 ° C, 30 sekund 56 ° C, 10 min 72 ° C) a inkubace po dobu 10 minut při teplotě 72 ° C. DNA získaná po posledním PCR se přímo transformuje na buňky kmene E. coli DH5 a umístí se na LA médium obsahující 20 ug / ml kanamycinu. Po inkubaci po dobu 12 hodin při 37 ° C se klony testují, plazmidová DNA se izoluje a provede se restrikční analýza. Výsledkem je plazmid S3 velikosti 2641 p.

Pro získání vektorového plazmidu pSX10 strávily tři kola amplifikace DNA pomocí PCR. Během prvního kola s použitím DNA plazmidu pSX3 jako templátu se provede amplifikace DNA fragmentu o velikosti 2025 bp. (fragment 10.1-10.2) za použití primerů:

Během druhého kola, za použití DNA plazmidu pKK223-3 jako templátu, se provede amplifikace fragmentu DNA o velikosti 528 bp. (fragment KK1-KK2) za použití primerů:

Ve třetím kole PCR byly fragmenty (10.1-10.2) a (CK1-CK2) kombinovány za následujících podmínek: zahřívání při 95 ° C po dobu 5 minut, 5 cyklů PCR (30 s 95 ° C, 30 s 56 ° C, 10 min 72 ° C) a inkubace po dobu 10 minut při teplotě 72 ° C. DNA získaná po posledním PCR se přímo transformuje na buňky kmene E. coli DH5 a umístí se na LA médium obsahující 20 ug / ml kanamycinu. Po inkubaci po dobu 12 hodin při 37 ° C se klony testují, plazmidová DNA se izoluje a provede se restrikční analýza. Výsledkem je plazmid pSX10 o velikosti 2553 p.

Konstrukce rekombinantního plazmidu pSX41

- Rekombinantní plazmid pSX41 je Hind III - BamHI fragment DNA vektorového plasmidu pSX3 (2529 bp), Hind III - EcoRI fragmentu DNA o velikosti 168 bp kódující tryptofanový operon promotor E. coli (Ptrp), Velikost fragmentu syntetické DNA EcoRI-XbaI o velikosti 20 p. O. kódující SD sekvenci (Shine-Dalgarno) a Xbal-BamHI DNA fragment 501 p. O. kódujícího lidský alfa 2b alfa 2b gen.

U HindIII - BamHI fragmentem DNA vektorového plasmidu pSX3 (2529 bp) DNA plazmidu pSX3 zpracuje restrikčními enzymy HindIII a BamHI a následně elektroforetické čištění v 1% agarózovém gelu. Hind III EcoRI 168 bp DNA fragment kódující promotor tryptofanového operonu (Ptrp) získané pomocí PCR za použití celkové DNA E. coli jako templátu a primerů TRP1 a PRP2, následované zpracováním amplifikovaného fragmentu restrikčními enzymy HindIII a EcoRI:

Pro získání fragmentu syntetické DNA EcoRI-Xbal o 20 bp kódující SD sekvenci (Shine-Dalgarno) se syntetizují následující komplementární oligonukleotidy:

VamIII Xbal-DNA fragment o 501 bp genu kódujícího inteferona lidského alfa 2b byl získán pomocí PCR za použití celkové lidské DNA jako templátu a primerů a IFN1 IFN2 následným působením amplifikovaného fragmentu s restrikčními enzymy Xbal a VamIII:

Dále se elektroforeticky purifikované fragmenty kombinují, ligují se enzymovou ligázou fágu T4, DNA se transformuje do buněk kmene E. coli DH5 a umístí se na LA médium obsahující 20 ug / ml kanamycinu. Po inkubaci po dobu 12 hodin při 37 ° C se klony testují, izoluje se plazmidová DNA, provede se restrikční analýza a stanoví se primární struktura DNA. Výsledkem je plazmid pSX41 velikost 3218 p. Potom proveďte postupnou mutagenezi interferonového genu, aby se zvýšila úroveň exprese cílového produktu. Mutagenese genu interferonu spočívá v nahrazení tripletů, které se zřídka nacházejí v E. coli, kódující odpovídající aminokyseliny s triplety, které se často nacházejí v E. coli kódujícím stejné aminokyseliny. Mutagenese DNA genu interferonu se provádí pomocí PCR.

Konstrukce rekombinantního plazmidu pSX43

Pro získání rekombinantního plazmidu pSX43 se provede jedno kolo amplifikace DNA pomocí PCR za použití plazmidu DNA pSX41 jako templátu a primerů IFN3 a IFN4:

PCR se provádí za následujících podmínek: zahřívání při 95 ° C po dobu 5 minut, 20 cyklů PCR (30 sekund 95 ° C, 30 sekund 56 ° C, 10 minut 72 ° C) a inkubace po dobu 20 minut při 72 ° C DNA získaná po PCR se přímo transformuje do buněk kmene E. coli DH5 a umístí se na LA médium obsahující 20 ug / ml kanamycinu. Po inkubaci po dobu 12 hodin při 37 ° C se klony testují, izoluje se plazmidová DNA, provede se restrikční analýza a stanoví se primární struktura DNA. Výsledkem je plazmid S43 velikost 3218 p.

Konstrukce rekombinantního plazmidu pSX45

Pro získání rekombinantního plazmidu pSX45 se provede jedno kolo amplifikace DNA pomocí PCR s použitím plasmidu DNA pSX43 jako templátu a primerů IFN5 a IFN6:

PCR se provádí za následujících podmínek: zahřívání při 95 ° C po dobu 5 minut, 20 cyklů PCR (30 sekund 95 ° C, 30 sekund 56 ° C, 10 minut 72 ° C) a inkubace po dobu 20 minut při 72 ° C DNA získaná po PCR se přímo transformuje do buněk kmene E. coli DH5 a umístí se na LA médium obsahující 20 ug / ml kanamycinu. Po inkubaci po dobu 12 hodin při 37 ° C se klony testují, izoluje se plazmidová DNA, provede se restrikční analýza a stanoví se primární struktura DNA. Výsledkem je plazmid pSX45 velikost 3218 p.

Konstrukce rekombinantního plazmidu pSX50.

Pro získání rekombinantního plazmidu pSX50 se provede jedno kolo amplifikace DNA pomocí PCR za použití plazmidu DNA pSX45 jako templátu a primerů IFN7 a IFN8:

PCR se provádí za následujících podmínek: zahřívání při 95 ° C po dobu 5 minut, 20 cyklů PCR (30 sekund 95 ° C, 30 sekund 56 ° C, 10 minut 72 ° C) a inkubace po dobu 20 minut při 72 ° C DNA získaná po PCR se přímo transformuje do buněk kmene E. coli DH5 a umístí se na LA médium obsahující 20 ug / ml kanamycinu. Po inkubaci po dobu 12 hodin při 37 ° C se klony testují, izoluje se plazmidová DNA, provede se restrikční analýza a stanoví se primární struktura DNA. Výsledkem je plazmid pSX50 velikost 3218 p.

Příklad 2. Získání kmene E. coli SX50 - výrobce interferonu

Kmen produkující interferon E. coli SX50 se získá transformací buněk kmene E. coli BL21 s rekombinantním plazmidem pSX50. Interferon produkující kmen se pěstuje v 30 l fermentoru na optickou hustotu 25,0 až 30,0 pu v médiu M9 obsahujícím 1% hydrolyzátu kyseliny kaseinové (Difco), 1% glukózy, 40 ug / ml kanamycinu při teplotě 38 až 39 ° C Při fermentačním procesu se kontinuální přidávání živného substrátu provádí pomocí gravimetrického regulátoru.

Obsah interferonu v biomase buněk získaných z 1 l kultury, v závislosti na sérii, je 0,9 až 1,0 g interferonu.

Příklad 3. Způsob izolace interferonu z kmene E. coli SX50

Získání interferonu bylo provedeno ve 4 fázích:

Stupeň 1 Kultivace E. coli SX50.

Stupeň 2 Izolace a čištění nerozpustné formy interferonu.

Stupeň 3 Rozpuštění a renaturace interferonu.

4 fáze. Chromatografické čištění interferonu.

Stupeň 1 Kultivace kmene E. coli SX50

Kultivované inokulum E. coli SX50 v objemu 3 litry LB bohatém médiu po dobu 12 hodin při teplotě 26 ° C se za aseptických podmínek zavede do fermentoru obsahujícího 27 litrů sterilního živného prostředí, obsahujícího M9, 1% hydrolyzát kaseinu kyseliny, 1% glukózy, 1 mM MgCI2, 0,1 mM CaCl2, 40 mg / ml kanamycinu. Kultivace ve fermentoru se provádí při teplotě 38-39 ° C, přičemž pH se udržuje na 7 ± 0,15 automatickým subtlací 40% roztokem hydroxidu sodného. Koncentrace rozpuštěného kyslíku v rozmezí (50 ± 10)% nasycení se udržuje změnou rychlosti míchadla ze 100 na 800 ot / min a přívodem vzduchu od 1 do 15 l / min. Koncentrace substrátů, zejména glukózy a kvasnicového extraktu, se měří během fermentace a udržuje se jejich koncentrace změnou rychlosti přivádění koncentrovaných roztoků pomocí peristaltických pump s použitím gravimetrického regulátoru.

Akumulace interferonu ve formě nerozpustné formy je řízena mikroskopií s fázovým kontrastem, elektroforézou na 15% polyakrylamidovém gelu (SDS-PAAG) a vysokoúčinnou chromatografií s reverzní fází (RF HPLC). Fermentace se zastaví po dosažení maximální optické hustoty (

25-30 PU a zastavit syntézu interferonu. Na konci fermentace se kultivační tekutina oddělí centrifugací v průtokovém rotoru rychlostí otáčení 5000 až 1 000 ot / min. Biomasa je zabalena do plastových sáčků a zmražena na teplotu minus 70 ° C.

Stupeň 2 Izolace a čištění nerozpustné formy interferonu

300 až 400 g zmrazené biomasy kmene E. coli SX50 se suspenduje v 3000 ml pufru 1 (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X100). Suspenze se vede přes homogenizátor průtoku typu Gaulin, udržuje se tlak 900 bar a centrifuguje se v průtokovém rotoru rychlostí 15 000 ot / min. Sraženina se postupně promyje pufry 2 (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 3M močovina) a pufr 3 (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) a nakonec se sraženina interferonu suspenduje v 200 ml pufru 3. Současně není doba izolace a čištění nerozpustné formy interferonu delší než 5 hodin.

Stupeň 3 Rozpuštění a renaturace interferonu

Do získaného v předchozím kroku se suspenze nerozpustné formy interferonu se přidá suchý hydrochlorid guanidinu na koncentraci 6 M, se přidá dithiothreitol v koncentraci 50 mM, Tris-HCl pH 8,0 v koncentraci 50 mM, NaCl do koncentrace 150 mM a Triton X-100 v koncentraci 0,1%, inkubována při při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Nerozpuštěný materiál se separuje filtrací sterilizací přes membrány s průměrem pórů 0,22 mikronů.

Renaturace interferonu se provádí pomalým zředěním výsledného roztoku 100-200 krát pufrem 4 (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). Poté se reaturační směs inkubuje za stálého míchání po dobu 12 až 15 hodin při teplotě 4 až 8 ° C. Potom se přidá síran hořečnatý do koncentrace 1 mM a agregovaný materiál se odstraní sterilizací filtrací přes membránový filtr s průměrem pórů 0,22 mikronů.

4 fáze. Chromatografické čištění interferonu

Chromatografické čištění interferonu se provádí ve třech stupních.

1. Výsledný renaturovaný interferon se nejprve čistí afinitní chromatografií na pryskyřici Chelating Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) imobilizovanou ionty Cu +2. K tomu se roztok interferonu aplikuje na kolonu Cu + 2 Chelating Sepharose Fast Flow a interferon se eluuje 0,1 M citrónovým pufrem pH 2,2.

2. Ve druhém kroku čištění chromatografií interferonu roztoku se nanese na kationtovou typu ionexy CM-Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) a gradientu eluuje roztok interferonu (0,0 až 0,5 M NaCl) v pufru 50 mM Na (CH3COO) pH 5,5.

3. Purifikace monomerní formy interferonu z reziduí polymerních forem interferonu se provádí ve třetím stupni čištění interferonu gelovou filtrací na pryskyřici typu Superdex 75 (Amersham Biosciences). Chromatografie se provádí v pufru 50 mm Na (CH3COO), pH 5,0, obsahující 0,15 M NaCl.

Popsaný způsob izolace a čištění interferonu umožňuje získat 4-8 g vysoce purifikovaného interferonu v jednom cyklu izolace po dobu 7-10 dnů z biomasy získané z 10 1 kultivačního média. Kvalita získaného interferonu plně vyhovuje požadavkům "Evropského lékopisu" pro látku interferon alfa-2b, a to:

- Koncentrace interferonu nejméně 2 × 10 8 IU / ml;

- Specifická aktivita interferonu je nejméně 2,0 × 10 8 IU / mg;

- Elektroforetická čistota léčiva není menší než 99% při redukčních a neredukujících podmínkách při barvení gelů stříbrem;

- Obsah správně renaturované formy interferonu je podle údajů RF RF HPLC alespoň 98%;

- Izoelektrický bod izolovaného interferonu je v oblasti pH 5,8-6,3;

- Peptidová mapa izolovaného interferonu se zásadně neliší od mapy peptidů pro evropský standard interferon alfa-2b CRS;

- Obsah bakteriálních endotoxinů není vyšší než 100 ME na 1 mg interferonu.

Jak je uvedeno v předchozích příkladech, nárokovaná skupina vynálezů umožňuje získat interferon alfa-2b s vysokým výkonem s relativně jednoduchou a spolehlivou technologií.

FORMULA VYNÁLEZU

1. Rekombinantní DNA plazmid pSX50, syntéza kódující rekombinantní lidský alfa-2b interferon, vyznačující se tím, že má velikost 3218 párů bází (bp) a skládá se z těchto fragmentů: sekvenci 1 až 176 nukleotidů (n.) Zahrnuje skupinu 176 bp DNA obsahující tryptofanový promotor (Ptrp), sekvence 177 až 194 n. zahrnuje syntetický DNA fragment o velikosti 18 p. O., obsahující sekvenci Shine Delgarno, zodpovědnou za zahájení translace, sekvence od 195 do 695 N. (A> C), 39 (G> T), 40 (A> C), 42 (G> T), 67 (A> C), 69 (G> T), 70 (A> C), 72 (A> T), 96 (G> A) (G> A), 330 (C> G), 339 (G> A), 342 (G> A), 487 C), 489 (A> T), 495 (G> A), sekvence od 696 do 713 n. zahrnuje syntetický fragment DNA o velikosti 18 p. O. obsahující syntetický polylinker, sekvenci od 714 do 1138 N. zahrnuje DNA fragment plazmidu pKK223-3 od 4129 do 4553 n. Velikost 425 bp, obsahující sekvenci striktního transkripčního terminátoru rrnBT1T2, sekvence od 1139 do 1229 N. zahrnuje DNA fragment plazmidu pUC19 od 2487 do 2577 N. velikost 91 p. O., obsahující promotor genu-laktomázu (gen pro rezistenci na ampicilin-Amp R), sekvence od 1230 do 2045 N. zahrnuje DNA fragment plazmidu pUC4K se 720 n. 1535 n. Velikost 816 bp, obsahující strukturní oblast kan genu, sekvence od 2046 n. na 3218 n. zahrnuje fragment DNA plazmidu pUC19 od 1625 do 453 n. Velikost 1173 bp, obsahující sekvenci zodpovědnou za replikaci plazmidu (ori) a lac promotor (Plac).

2. Kmen bakterie Eschcerichia coli SX50 transformovaný rekombinantním plazmidem podle nároku 1 - produkující rekombinantní lidský leukocytový interferon alfa-2b.

3. Způsob výroby lidského interferonu alfa-2b včetně kultivace kmene Escherichia coli SX5 podle nároku 2 v živném médiu s konstantním přidáváním živných substrátů během biosyntézy, mechanickou destrukcí buněk mikroorganismu při tlaku 700 až 900 bar, rozpouštění interferonu v tlumivém roztoku guanidin hydrochloridu, renaturaci interferonu ve fyziologických pufrovacích roztokech v přítomnosti chaotropních činidel, třístupňové chromatografické čištění interferonu na pryskyřicích Chelating Sepharose Fast Flow imobilizovaných ionty Cu + 2, iontoměničovou chromatografií na iontoměničových pryskyřicích, jako je CM Sepharose Fast Flow a gelovou filtrační chromatografií na pryskyřicích jako je Superdex 75.

4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se kultivace provádí na živném prostředí s nízkým obsahem tryptofanu s kontinuálním přidáváním živných substrátů, výhodně glukózy a kvasnicového extraktu.

5. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že před rozpuštěním interferonu se čistí odstraněním rozpustných buněčných složek, včetně DNA, RNA, proteinů, lipopolysacharidů, promytím pufrovými roztoky obsahujícími detergenty jako je Triton XI 00, močoviny.

6. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že po každém chromatografickém čištění se sterilizační filtrace provádí přes filtry o velikosti pórů 0,22 um.

Předchozí Článek

V chladu se ztratil zápach